陈明海开发生物传感系统,在不同尺度检测蛋

核酸和蛋白质是组成生命的主要生物大分子。在生物体内，蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA之间存在密切的相互作用，这些相互作用是生物体生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动的基础。

如果某个分子或某些分子动力学特征（形状、结构和运动状态）发生改变，可能会对人体健康产生影响。因此，研究蛋白质/核酸互作等重要生物分子事件，对于解析病毒生物学和肿瘤生物学等关键科学问题具有重要意义。

传统生化方法无法直观、真实展现蛋白质/核酸互作等重要生物分子事件。通过生物学、化学等不同学科交叉，开发活细胞/活体生物分子互作传感技术，解析潜在的关键分子机理，已成为推动细胞生物学等领域研究的有力工具。

近日，络绎科学邀请到了中国科学院深圳先进技术研究院（以下简称为“深圳先进院”）合成生物学研究所副研究员、硕士生导师陈明海围绕“基于片段互补的生物分子传感系统开发及应用”这一主题进行分享，报告了基于荧光蛋白以及荧光素酶等分子探针开发的合成生物传感系统。

▲图丨陈明海（来源：陈明海提供）

陈明海于年获得中科院武汉病毒研究所微生物学专业博士学位，随后前往弗吉尼亚大学生物化学专业开展博士后研究工作。年7月，他加入中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所，任副研究员职位，主要研究方向是基于合成生物学技术发展新型荧光传感系统用于生物体内关键分子事件的检测及相关机理的研究。相关研究成果以第一作者或共同通讯作者发表于ACSNano,Biomaterials,Chem.Sci.,Anal.Chem.等专业期刊。

开发基于片段互补技术的生物分子传感系统

生物体的许多生命过程，如细胞的信号传导、细胞骨架的形成以及细胞的代谢，均受到蛋白质之间相互作用的调控。目前研究蛋白质相互作用的方法主要有：基于抗原抗体相互作用的免疫共沉淀、表面等离子体共振技术、用于大规模筛选的酵母双杂交系统，以及基于供体与受体之间的荧光共振能量转移技术。

陈明海团队基于片段互补技术开发了系列、多尺度可视化研究蛋白质/核酸互作等合成生物分子传感系统。

“目前有很多的功能蛋白被拆分作为片段互补系统来检测蛋白质之间的互作。如果选用的功能蛋白是荧光蛋白，所构建的互补系统就叫做双分子荧光互补系统（BimolecularFluorescenceComplementation，BiFC）。”他介绍说。

（来源：陈明海提供）

它的基本原理就是以荧光蛋白作为材料，根据其序列和结构，在合适的拆分位点将其拆分成两个没有功能的荧光蛋白片段，然后将这两个蛋白片段分别通过Linker与待研究的两个蛋白相互融合。如果两个目的蛋白彼此间存在相互作用，或者是在配体的作用下可以形成蛋白相互作用复合体。这样就可以使拆分的两个功能蛋白的片段彼此融合，产生完整的一个功能蛋白，从而发挥功能即产生荧光。

陈明海介绍道，目前荧光蛋白大致分为两类。

一类是大家所熟悉的绿色萤光蛋白(Greenfluorescentprotein，简称GFP)，其晶体结构显示，蛋白质是一个圆柱形水桶样结构，由11个围绕中心α螺旋的反向平行β折叠组成，发色团位于桶状结构内部的一个α螺旋上，主要通过氨基酸的氧化和环化来产生荧光。

另一类是近十年刚报道的来源于细菌的光敏色素蛋白。目前这种光敏色素被广泛用于不同的细胞组织以及活体成像。该类蛋白具备如下特点，第一是具有比较大的激发峰和发射峰，均在接近nm的近红外区域，很多都是在光学窗口的范围内；第二是它的结构与大家所熟知的GFP的桶状结构有很大的不同，通常包含两个结构域，或者是单个结构域，而不是这种明显的桶状结构；第三也是最重要的一点是它的发色团是胆绿素，胆绿素是正常的细胞代谢过程中所产生的一种小分子物质，内源性的低浓度的胆绿素就可以使它产生很强的荧光。

两个蛋白质互作的检测及系统技术优化

“为了开发基于光敏色素蛋白的双分子荧光互补系统，团队选择了一种近红外的光敏色素荧光蛋白——iRFP，它的最大激发峰是在nm，最大发射峰是在nm，已经被证实可以很好地在动物活体上进行荧光标记。”陈明海说道。

具体来说，首先根据该荧光蛋白的空间结构，在它的loop环内共选取了多个拆分位点，发现有四个位点可成功构建双分子荧光互补系统，之后在动物活体上验证了检测蛋白质互作的可行性。

“团队还将这个互补系统应用于研究HIV-1的整合酶与宿主细胞的因子p75之间的相互作用，发现p75蛋白在靶标HIV-1的基因组整合到宿主细胞染色体的过程中起到了很关键的作用。并且基于这个系统筛选和评价了一些抑制剂，为HIV-1生命周期的理解以及防治提供了相应的研究基础。”

不过，近红外的光敏色素荧光蛋白的波长比较长，光量子产率较低，导致它的相对的荧光强度要显著的低于大家熟知的GFP类型的荧光蛋白。这对于研究蛋白质之间的弱相互作用可能就会有一定的限制。

“所以，团队尝试通过串联构建的策略来提高它的互补荧光强度。”

具体来说，将多个拆分的N末端片段与多个拆分的C末端片段分别与待研究的两个蛋白相互融合。如果这两个蛋白彼此间存在相互作用，就会使拆分的多个N末端片段与多个拆分的C末端片段重构，这样理论上是可以产生更强的互补荧光。

最后，团队也在活细胞及活体上证实了，通过串联构建的策略产生的互补系统的荧光强度是目前在近红外区域的互补系统中是最强的。

接下来，团队又考虑到，由于拆分的荧光蛋白片段是分别作为tag与靶标蛋白相互融合表达的，如果这两个荧光蛋白片段太大，理论上可能会对待研究的两个蛋白之间的相互作用产生影响。

为了降低这种影响，陈明海团队以年新开发的一个荧光蛋白作为材料，成功开发了近红外的BiFC系统。这个荧光蛋白的最大发射峰是在nm，它是目前蛋白分子量最小的荧光蛋白，仅由个氨基酸组成。

“经测定，与目前报道的这种近红外的荧光互补系统相比，该系统的成熟速度和光稳定性都要更加优越。”

基于这一系统，团队首次在活细胞水平上鉴定了新冠病毒的N结构蛋白与细胞应激颗粒蛋白（如G3BP1、G3BP2）之间的相互作用。结合生化实验进一步发现，N蛋白的表达可以降低细胞应激颗粒蛋白G3BP1的表达水平，这些可能在新冠病毒入侵细胞过程中起到了一定的作用。

三个蛋白质互作的检测及超高分辨成像

在生物体内，不仅有两个蛋白质之间的互作，很多时候涉及到多个蛋白质之间的互作。能否在双分子荧光互补系统的基础上进一步延伸，开发一个检测三个蛋白质之间互作的系统呢？

同时在普通光学成像的过程中，由于受到光的衍射极限的限制。目前的共聚焦所能达到的分辨率大概是在横轴nm和纵轴nm的范围内。而很多蛋白质之间的互作通常是发生在十几纳米的空间内。

如果可以在超高分辨的水平或者是单分子的水平上来检测这些蛋白质之间的互作，对于理解这些互作所发挥的功能将有很大的帮助。

目前超高分辨成像技术主要是基于两类原理，第一类是通过改造光源的点扩散函数来实现超高分辨成像。另外一种是基于单分子成像的超分辨成像技术。

“团队选取了荧光蛋白mIrisFP，其一方面具有光转换的特性；另一方面它还具有光转化的特性。光转换特性为做单子成像提供了一个前提。”

将荧光蛋白mIrisFP拆分成三个片段，然后分别与待研究的三个蛋白相互融合。原理同上。这个系统被命名为三片段荧光互补系统(TFFC)。

（来源：陈明海提供）

根据它的结构以及序列比对，团队成功构建了TFFC系统，通过测定，发现拆分重构后的系统同样具有这种光转换的特性。而且团队也在单分子水平上做了三个蛋白质之间的超高分辨成像，揭示了G蛋白不同亚基在单分子水平上是有不同的互作形式。

在此基础上，能否将系统适当改造用于研究蛋白质与RNA之间的互作呢？

团队的想法是，通过MCP与ms2的特异性相互作用，将荧光蛋白拆分的一个片段首先锚定下来，然后将另一个片段与待研究的目的蛋白相互融合。检测原理同上。

团队首先找到一些模式的蛋白和RNA的互作，证实了这样一个系统是可以成功构建的。

（来源：陈明海提供）

基于这个系统，团队在肿瘤细胞中鉴定了细胞骨架蛋白FSCN1与长链非编码RNAHOTAIR之间的互作，以及它们互作的区域。由于长链非编码RNAHOTAIR在肿瘤的生长发育以及迁移过程中起到一定的作用，因此FSCN1-HOTAIR互作的鉴定对于肿瘤功能研究可能有一定的帮助。

总的来说，基于mIrisFP的三片段的荧光互补系统既有优点也有缺点。优点是它具有光转换的特性，可以在单分子水平上来检测多个蛋白的互作。缺点则是该互补系统需要在低温条件下，也就是27℃条件下才能够成熟，产生互补的荧光。这样一来，对于在生理条件下多个蛋白质互作的检测可能会有一定的限制。

因此，团队想要开发一个在生理条件下成熟，且又能应用于三个蛋白质互作研究的三片段的荧光互补系统。

团队以一个具有高荧光亮度的荧光蛋白Venus作为材料，成功地构建了在生理条件下成熟的三片段的互补系统。并且基于该互补系统，首次在活细胞水平鉴定得到，HIV-1的整合酶与宿主细胞因子BAF和p75之间可以形成一个稳定的三蛋白复合物。该发现有助于理解HIV-1基因组整合的相关机理。

前面讲的双分子荧光互补系统通常是将一个荧光蛋白拆分成两个片段，然后分别与待研究的两个蛋白相互融合。如果团队将荧光蛋白拆分成两个片段之后，再通过linker连接，就可以构建成一个cp的荧光蛋白。这样的cp荧光蛋白同样也具有荧光，有时候可能会比较弱。但是这样的结构很容易受到周围环境以及结合的影响，因此为构建传感器提供了很好的材料。

基于此，团队开发了一个特异性检测锌离子的传感器。该检测可以在一定程度上评价胰岛细胞分泌胰岛素的功能水平。这一成果可能为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一定的参考。

基于荧光素酶的分子传感器的开发及应用

此外，陈明海还介绍了团队基于荧光素酶的分子传感的开发及应用。

荧光素酶系统的特点是，其基于酶与底物催化之间的反应产生荧光，因此具有比较高的特异性，组织穿透能力比较强，适用于活体成像。

团队选用了一个具有近红外光谱性能的荧光素酶系统。原理同上，成功构建了基于拆分荧光素酶的互补系统。并在动物活体上验证，该系统可以很好地成像蛋白质之间的相互作用。

与目前广泛使用的红色的荧光素酶互补系统Fluc-SLCA相比，该系统不论是在活细胞水平还是在活体水平，均展现出比较好的成像蛋白质互作的性能。

将该系统应用于研究新冠病毒的N结构蛋白与细胞的一些RNA处理过程蛋白之间的互作以及抑制剂筛选中，最终筛选到Sapanisertib能够抑制细胞蛋白RPL36与新冠N蛋白之间的相互作用。这些发现可能为新冠病毒的防治提供相应的候选药物。

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